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技术服务

目的区域富集测序

目的区域富集测序(FastTargetT/ EasyTargetTM/ 液相芯片 / long-PCR富集)

技术简介:

       目标区域测序(Targeted Sequencing):是指针对感兴趣的目标区域富集后进行大规模测序。研究者可以针对自己感兴趣的染色体区域或者大量的候选基因区域进行数百个甚至上千个样品的序列测定。目前,天昊生物提供4种目标区域富集方法:定制液相芯片富集、 Long-PCR富集、FastTarget富集和EasyTarget ®富集。


• 定制液相芯片富集
      该富集方法利用商业Agilent SureSeclect 液相芯片富集捕获系统,设计定制研究目标区域的相关捕获探针,通过探针与样品片段化DNA的杂交和富集,将捕获之后洗涤获得的目标区域片段进行文库构建,并进行扩增后利用Illumina Hiseq 高通量二代测序系统进行PE150的测序,对所获得测序数据进行生物信息学的读取、质控及分析,寻找研究感兴趣的序列及序列差异。该方法非常适合300kb-17Mb区域的多个候选基因外显子或连续区域富集二代测序项目。

• Long-PCR富集
      该技术基于针对目的区域设计long PCR扩增反应的富集方法,对研究者感兴趣的基因组区域进行捕获,一次扩增可以直接获得4-6kb的连续的基因组区域。后续,利用Illumina Hiseq 测序仪的2×150bp测序模式对目的片段实现双向测序,对所获得测序数据进行生物信息学的读取、质控及分析,寻找研究感兴趣的序列及序列差异。该方法非常适合<200Kb的连续目的区域富集二代测序项目。

•  FastTarget富集
      FastTarget技术针对目的区域设计多重PCR扩增体系,从而达到富集目的片段的目的,对研究者感兴趣的基因组区域进行捕获富集。一个扩增反应体系可以完成16-20个PCR反应,直接获得4Kb左右的基因组区域,该技术方法非常成熟,方法快速、操作简单,无需复杂的建库过程。后续,利用Illumina Miseq测序仪的2×250bp测序模式或Illumina Hiseq 测序仪的2×150bp测序模式对目的片段实现双向测序,对所获得测序数据进行生物信息学的读取、质控及分析,寻找研究感兴趣的序列及序列差异。该方法非常适合<200Kb的多个候选基因外显子富集二代测序项目。

•  EasyTarget ®富集
      该技术为上海天昊生物的专利技术,针对目的区域设计的EasyTarget引物及探针,通过延伸连接反应富集目的片段,对研究者感兴趣的基因组区域进行捕获富集。一个延伸连接反应体系可以获得<200Kb的区域内所有目的片段的连接产物,该技术方法实验快速、步骤简单,直接富集扩增效率极高,无需复杂的建库过程。后续,利用Illumina Miseq测序仪的2×250bp测序模式或Illumina Hiseq 测序仪的2×150bp测序模式对目的片段实现双向测序,对所获得测序数据进行生物信息学的读取、质控及分析,寻找研究感兴趣的序列及序列差异。该方法非常适合<200Kb的多个候选基因外显子富集二代测序项目。

应用领域:


     • 候选基因突变筛查
     • 复杂疾病关联分析
     •  临床疾病诊断

技术优势:


     • 针对性强:比起全基因组水平的研究,目标区域测序更具有针对性,可以依赖大量的前期研究成果,获得候选染色体区域或者基于生物通路的大量候选基因。
     • 费用低:目标区域测序区域较小,可对数百个样品进行快速测序,大大降低了研究成本。
     • 信息量大:比起目标区域或者候选基因单倍型标签SNP分型的研究策略,目标区域测序可以完整覆盖整个基因区域,不仅可以获得高频SNP的分型数据,而且还可以发现低频的和个体特有的变异。
     • 效率高:比起使用Sanger法的候选基因测序方法,基于二代测序技术的目标区域测序更加快速、高效。
     • 高精度:目标区域的高测序深度保证了更准确的测序结果,例如目标区域测序的测序深度可以达到200×。

技术参数与实验流程


技术参数


富集方法 样本要求 测序策略 数据要求
定制液相芯片富集
  • 样品类型:DNA
  • 样品需求量:总量>2µg
  • 样本浓度:不能低于50ng/µl
  • 样品质量:260/280介于1.7-2.0之间
  • 样本无明显降解
  • Hiseq 2×150
  • 所有样本目标区域测序深度平均>200×,Q30>80%
Long-PCR富集
  • 样品类型:DNA
  • 样品需求量:总量需求 (单个片段需要40ng)
  • 样本浓度:不能低于20ng/µl
  • 样品质量:260/280介于1.7-2.0之间
  • 样本无明显降解
  • Hiseq 2×150
  • 所有样本目标区域测序深度平均>200×,Q30>80%
FastTargetTM富集
  • 样品类型:DNA
  • 样品总量:总量需求 (单个Panel需要40ng)
  • 样本浓度:不能低于20ng/µl
  • 样品质量:260/280介于1.7-2.0之间
  • Hiseq 2×150
  • Miseq 2×250
  • 所有样本目标区域测序深度平均>200×,Q30>80%
EasyTarget ®富集
  • 样品类型:DNA
  • 样品总量:总量需求 (单个Panel需要1ug)
  • 样本浓度:不能低于50ng/µl
  • 样品质量:260/280介于1.7-2.0之间
  • Hiseq 2×150
  • Miseq 2×250
  • 所有样本目标区域测序深度平均>200×,Q30>80%

试验流程


    A.  建库测序流程

  1. 定制液相芯片富集建库测序流程



  1. Long-PCR富集建库测序流程



  1. FastTargetTM富集建库测序流程



  1. EasyTarget ®富集建库测序流程



    B.  数据分析流程

基本分析内容 高级分析内容 单基因病分析内容 复杂疾病分析内容 肿瘤分析内容 天昊特色分析内容
  • 原始数据整理、质量评估
  • 序列过滤、统计富集效率
  • 参考基因组比对与注释统计
  • SNV/InDel/CNV检测,注释,统计
 
  • 突变位点过滤(数据库过滤,匹配正常样本过滤)
  • 依据家系信息进行遗传模式分析
  • 候选致病基因功能注释
  • 候选致病基因通路富集分析
  • 基于家系连锁分析
  • 纯合区域策略分析
  • 突变位点过滤(数据库过滤,匹配正常样本过滤)
  • 依据家系信息进行遗传模式分析
  • 常见变异的关联分析
  • 罕见变异的基因负荷检验
  • 候选致病基因功能注释
  • 候选致病基因通路富集分析
  • Somatic SNV/InDel/CNV检测,注释,统计
  • 不同阶段样本突变谱差异统计
  • 高频突变基因统计
  • 肿瘤异质性/克隆进化分析
  • 天昊二代测序数据验证试剂盒完成96个SNP分型,分析与二代测序结果的一致性

经典案例解读

【单基因病】

      天昊生物与复旦大学附属华山医院皮肤科张正华副教授团队合作研究成果 “Genomic Variations of the Mevalonate Pathway in Porokeratosis” 于2015年7月23日在生命科学领域的权威杂志《elife》上发表, 该杂志是由来自美国、英国、德国的三大科学基金资助机构(Howard Hughes Medical Institute, the Max Planck Society & the Wellcome Trust)新创办的一个开放性综合学术期刊,现任主编是2013年诺贝尔生理学或医学奖获得者Randy Schekman,在欧美享有较高声誉,其2014年的影响因子为9.322。公司总经理姜正文博士为共同通讯作者,全资子公司上海天昊生物科技有限公司遗传分析中心生物信息部经理李才华为文章的共同第一作者。

文章解读请点击链接:

http://biotech.geneskies.com/ch/news/company/347.html

【肿瘤】

       浙江大学医学院附属第一医院肖浩文教授团队与天昊生物合作,利用全外显子组测序技术和FastTarget目的区域富集测序技术相结合,成功解析了费城染色体阴性成人急性淋巴细胞白血病在异基因造血干细胞移植后复发的遗传因素,首次提出复发患者存在表观遗传调控基因突变的富集,文章于近日发表于oncotarget杂志。天昊基因为此项研究提供了外显子组测序、FastTarget目的区域富集测序以及后续生物信息分析工作,天昊生物生物信息部经理李才华作为文章的作者之一分享了这一研究成果。

文章解读请点击链接:

http://biotech.geneskies.com/ch/news/company/418.html

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