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目的区域富集甲基化测序(MethylTarget)

目的区域富集甲基化测序(MethylTarget)

技术简介:

      甲基化是一种非常重要的表观遗传学标记信息,参与了包括基因调控、生物发育、疾病等方方面面,并且在大多数癌症中广泛发现甲基化异常。除了对于全基因组甲基化水平的观察与研究,对于众多目的候选基因的甲基化水平研究则更有针对性和大样本可行性。使用亚硫酸盐将DNA进行修饰后,天昊生物结合目的区域富集和二代测序技术,推出自主研发的目的候选基因区域甲基化水平测序技术——MethylTarget,在大幅度降低研究费用的同时实现个性化目的区域测序检测(targeted bisulfite sequencing)。

基本原理:


技术优势:


     • 基于二代测序,可以获得目标区域内所有C的甲基化数据。
     • ~500×的测序深度,精确计算每个位点C的甲基化程度。
     • 通量高,可同时对成百上千个区域进行甲基化程度分析。
     • 适用于大样本多区域的DNA甲基化水平检测。

技术参数与实验流程


技术参数


样本要求 测序策略 数据要求
  • 样品类型:DNA
  • 样品需求量:总量>1µg 
    (满足70个目的片段测序)
  • 样本浓度:不能低于20ng/µul
  • 样品质量:260/280介于1.7-2.0之间
  • 样本无明显降解
  • 测序平台:Miseq 2×250或2×300(适用于大片段);
  • Hiseq 2×150(适用于较大样本量和较多片段数目,比较经济);
  • 测序深度:Miseq 500×;
  • Hiseq 1000×;
Miseq
  • 所有样本目标区域测序深度平均>500× 
    Q30>80%,
  • 90%样本测序深度>350×
  • 平均测序深度>350×的样本, 
    90%以上的测序片段测序深度大2×
Hiseq
  • 所有样本目标区域测序深度平均>1000×, 
    Q30>80%。
  • 90%样本测序深度>500×。
  • 平均测序深度>500×的样本 
    90%以上的测序片段测序深度>10×。

实验流程

建库测序流程



数据分析流程



经典文章解读

       本研究关注儿童注意缺陷多动障碍(ADHD)的甲基化机制。 研究者选取脑组织临近样本--唾液DNA为研究样本。全基因组甲基化芯片确认VIPR2 为ADHD差异候选基因。目的候选基因区域甲基化水平测序验证了包括VIPR2在内的43个位点, 提示唾液DNA可能被用作精神疾病研究的脑组织替代材料。

       Wilmot, B, et al. (2015) Methylomic analysis of salivary DNA in childhood ADHD identifies altered DNA methylation in VIPR2. The Journal of Child Psychology and Psychiatry. Doi: 10.1111/jcpp.12457

       研究者采用候选基因区域甲基化水平测序探究了三个人半乳糖凝集素 编码基因的甲基化水平在先兆子痫中的作用。结果发现,这些基因内的多个关键差异甲基化CpG位点与 疾病发生相关。结合其它研究,研究者指出,这些差异甲基化CpG位点可能影响滋养细胞的半乳糖凝集素 基因簇表达。

       Than NG, et al. (2014) Evolutionary origins of the placental expression of chromosome 19 cluster galectins and their complex dysregulation in preeclampsia. Placenta 35 (11):855-865.

       研究者采用全基因组甲基化水平测序,结合目的候选基因区域甲基化水平测序验证,探究了非洲裔美国人的结肠癌相关甲基化markers 。全基因组检测明确了13个基因的355个差异甲基化CpG 位点,以及癌症样本中的低甲基化长散在重复序列。后续,在42个样本中对甲基化差异排名前50 的CpGs 位点进行目的区域甲基化测序验证,最终明确了非洲裔美国人结肠癌相关的4个甲基化markers: EID3, BMP3, GAS7和GPR75。

      Ashktorab, H, et al. (2014) DNA methylome profiling identifies novel methylated genes in African American patients with colorectal neoplasia. Epigenetics. 9(4): 503-512

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