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mRNA甲基化(m6A)测序

mRNA甲基化(m6A)测序

服务介绍:

      m6A甲基化修饰是真核生物mRNA和长非编码RNA上一种普遍的RNA修饰方式,参与多种转录后调控过程。mRNA甲基化测序是以RNA免疫共沉淀(RIP)为基础,采用特异抗体对发生m6A甲基化修饰的RNA片段进行富集后测序的技术手段,可以获得特定细胞在某一功能状态下或者特定发育阶段的mRNA m6A甲基化修饰图谱,并且可比较多个样品间差异。

技术优势:

     • 开放的全转录组分析:无需预先设计探针,无需预知mRNA甲基化位点信息;
     • 信息量大:在全转录组水平上获得mRNA和poly(A)+长非编码RNA的甲基化修饰区域信息;
     • 准确性高:以未经抗体富集的mRNA文库作为input对照,校正mRNA表达量的影响,获得准确可靠的甲基化区域信息。

服务特色

技术参数:


mRNA甲基化(m6A)测序
样品要求 a) 样本类型:完整无基因组DNA污染的Total RNA;
b) 样本需求量:总量 ≥ 250 μg,浓度 ≥ 200 ng/μL;
c) 样本纯度:OD260/280 = 1.8~2.2,OD260/230 ≥ 2.0;
d) 样本完整度:Agilent 2100 Bioanalyzer 检测RIN值 ≥ 7.0,28S/18S ≥ 1.0;
文库类型 Poly(A)+文库
测序策略 HiSeq PE150;12G raw data (包括Input和IP两个文库各6G raw data)
分析内容 基础分析
1) 原始测序数据预处理
2) 数据质量过滤
3) 参考序列比对分析
4) mRNA表达定量分析 (基于Input文库)
5) 甲基化区域预测
6) 甲基化区域motif分析
7) 甲基化的转录本分布特征分析
8) 甲基化差异分析与基因注释
9) 甲基化差异基因GO富集分析
10) 甲基化差异基因KEGG富集分析
高级分析
11) mRNA表达与甲基化联合分析
个性化分析
可结合客户的材料与需求,协商确定定制化信息分析内容。

技术路线图:

数据分析内容:

数据分析流程图

天昊m6A测序平台结果展示:

• 统计每组样本中识别到的peak的个数,peak的最小长度,最大长度,平均长度等信息,结果如下表所示。


Sample Peak num Peak coverage (bp) Median peak width (bp) Min fold enrichment Median fold enrichment Max fold enrichment
S1 17131 66018608 514 1.09 3.65 84.30
S2 18516 70193753 502 1.07 3.73 57.50
S3 18425 68536532 481 1.08 3.91 51.50

• motif分析结果示意图

• m6A Peak在5'UTR、CDS和3'UTR区域内的分布

典型案例:

• 肿瘤研究:研究者发现急性髓细胞样白血病肿瘤细胞中m6A修饰关键酶存在表达异常;通过敲低和过表达该m6A修饰酶,研究者观察到了肿瘤细胞表型变化;后续结合m6A-seq和RNA-seq,寻找到了急性髓细胞样白血病肿瘤细胞中m6A修饰酶主要靶标mRNA。

参考文献:Li Z, Weng H, Su R, Weng X, Zuo Z, Li C, Huang H, Nachtergaele S, Dong L, Hu C et al: FTO Plays an Oncogenic Role in Acute Myeloid Leukemia as a N6-Methyladenosine RNA Demethylase. Cancer Cell 2017, 31(1):127-141.

• 肿瘤研究:研究者发现m6A整体甲基化在肝癌下调;后续进一步发现METTL14基因表达在肝癌组织中显著下调;基于功能试验,发现METTL14敲除可增强肝癌转移;基于miRNA测序,进一步寻找METTL14下游靶miRNA。

参考文献:Ma JZ, Yang F, Zhou CC, Liu F, Yuan JH, Wang F, Wang TT, Xu QG, Zhou WP, Sun SH: METTL14 suppresses the metastatic potential of hepatocellular carcinoma by modulating N6 -methyladenosine-dependent primary MicroRNA processing. Hepatology 2017, 65(2):529-543

• 发育研究:研究者鉴定了斑马鱼中的m6A甲基转移酶复合体成分;通过缺失m6A甲基转移酶mettl3,研究者发现m6A在胚胎发育相关mRNA中的富集程度显著下降;进一步的m6A-Seq和RNA-Seq综合分析发现,缺失m6A甲基转移酶mettl3,会造成造血干细胞不能正常产生,一系列动脉内皮发育相关的基因表达异常。

参考文献:Zhang C, Chen Y, Sun B, et al. m6A modulates haematopoietic stem and progenitor cell specification.[J]. Nature, 2017, 549(7671):273.

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