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肿瘤组织和cfDNA外显子组捕获测序

肿瘤组织和cfDNA外显子组捕获测序

服务介绍:

      肿瘤因体细胞突变(Somatic Mutation)积累引起。相较于常规样本中生殖突变(Germline Mutation)位点的检测,肿瘤样本因为纯度低、异质性高、突变频率低等原因,需要更高的测序深度、更优化的数据分析方法才能更有效精确地鉴定其中的突变位点。

      全外显子组测序(Whole Exome Sequencing,WES),作为大规模组学研究的常备技术,是一种利用杂交技术将全基因组外显子区域DNA捕获富集后进行高通量测序,从而鉴定并发现与蛋白质结构、功能变异相关突变的技术手段。相较于全基因组测序(Whole Genome Sequencing,WGS),全外显子组测序更加经济、高效,在相同测序成本条件下,可以高深度地检测更多的实验样品,更为精准地鉴定常见变异以及罕见变异,高效发现全新突变。

      天昊生物使用全自动核酸抽提工作站,确保样本抽提的稳定性,最大程度避免样本间污染;使用业内最优的Covaris超声基因组片段化方案,结合精心优化的文库构建体系进行DNA文库构建,最大程度地保证文库转化效率,在满足高深度测序的同时,尽可能减少珍贵实验样本的消耗;高口碑的Agilent SureSelect Human All Exon V6芯片,捕获效率优,目标区域覆盖均匀度高;多重保障确保肿瘤样本体细胞突变检出的灵敏度和特异性。

技术优势:


     •  金标准:使用业界公认的Agilent SureSelect Human All Exon V6芯片。
     •  一代验证:免费使用SNPscan®技术确保样本中高频突变检出的准确性。
     •  高性价比:相较全基因组测序,相同测序量可高深度地检测更多实验样品。

应用领域:


      多个癌种。

技术路线图



技术参数及分析内容


样本类型 对照样本(血细胞、口腔上皮、癌旁) 实体瘤 FFPE 血浆
样品要求 DNA
    •   样品需求量:Qubit检测,要求浓度 ≥ 20 ng/μL;总量 ≥ 1 μg;
    •  样品纯度:无色透明,OD260/280 = 1.7~1.9;OD260/230 ≥ 2.0;
    •  样品完整度:琼脂糖电泳检测,要求主条带清晰,无明显弥散及拖尾,且无RNA污染。
    •  样品保存和运输要求:-20°C保存,冰袋运输;
    •   样品需求量:Qubit检测,要求浓度 ≥ 20 ng/μL;总量 ≥ 1 μg;
    •  样品纯度:无色透明,OD260/280 = 1.7~1.9;OD260/ 230 ≥ 2.0;
    •  样品完整度:琼脂糖电泳检测,要求主条带清晰,无明显弥散及拖尾,且无RNA污染。
    •  样品保存和运输要求:-20°C保存,冰袋运输;
    •   样品需求量:Qubit检测,要求浓度 ≥ 20 ng/μL;总量 ≥ 1 μg;
    •  样品纯度:无色透明,OD260/280 = 1.7~1.9;OD260/ 230 ≥ 2.0;
    •  样品完整度:琼脂糖电泳检测,要求SMEAR条带 > 500 bp,且无RNA污染。
    •  样品保存和运输要求:-20°C保存,冰袋运输;
    •   样品需求量:Qubit检测,要求浓度 ≥ 0.5 ng/μL;总量 ≥ 50 ng;
    •  样品纯度:无色透明;
    •  样品完整度:Agilent2100检测,主峰位于约160 bp,无大片段污染。
    •  样品保存和运输要求:-20°C保存,干冰运输;
其他 参照《天昊生物样本质控要求及服务说明》提供的样本保存和运输要求操作,要求组织/细胞样品抽提出的基因组DNA满足对应服务要求。
测序策略 Hiseq 2×150bp
测序量 12G/25G/50G原始测序量;目标区域测序深度100×/200×/500×;测序深度达到20×/100×/200×的碱基比例>90% 12G/25G/50G原始测序量;目标区域测序深度100×/200×/500×;测序深度达到20×/100×/200×的碱基比例>90% 16G/35G/70G原始测序量;目标区域测序深度100×/200×/500×;测序深度达到20×/100×/200×的碱基比例>80% 12G/25G/50G原始测序量;目标区域测序深度100×/200×/500×;测序深度达到20×/100×/200×的碱基比例>80%
分析内容 标准分析 高级分析 个性化信息挖掘
测序数据汇总及数据质量评估 高频突变基因相关性分析 临床信息整合分析
比对到参考基因组及注释统计 高频CNV分析 多组学信息整合分析
Somatic SNV/InDel/SV/CNV检测、注释、统计 突变谱差异统计分析
易感基因筛查 瘤内纯度及倍性分析
高频突变基因统计及通路分析 瘤内异质性及克隆进化分析

案例分析

EGFR突变的晚期肺癌患者中共现的遗传变异对进化和临床的影响

Evolution and clinical impact of co-occurring genetic alterations in advanced-stage EGFR-mutant lung cancers

期刊:Nature Genetics

发表时间:2017年11月

影响因子:27.959

第一单位:Department of Medicine, University of California, USA

背景简介:

       关于癌症遗传学和治疗当前主要关注某一种致癌基因呈阳性的疾病,例如非小细胞肺癌中EGFR突变,但是这种方法并没有解决癌症中一些共现的遗传变异的潜在风险。那么这些共现的遗传变异究竟能达到怎样的程度,与主要的驱动基因(如EGFR)共同促进肿瘤发展和治疗抗性?本研究就提出这样的假设:共现的遗传变异普遍存在,而且与主要的驱动基因组成共驱动基因(co-drivers),从而促进肿瘤进展并且限制靶向治疗的效果。

研究方法:

      收集1122例EGFR突变阳性和1008例突变阴性的晚期肺癌患者的全血样本,对其中游离的DNA(cfDNA)进行68个临床相关的基因的外显子进行测序分析。并且对一例EGFR突变肺癌患者的7份纵向收集的样本进行全外显子测序。

主要结果:

     • 晚期EGFR突变肺癌患者cfDNA分析:首先在EGFR突变阳性和阴性组之间发现了部分共现的突变基因,而且有显著差异(图1)。而且在440例EGFR p.Thr790Met突变阳性和682例突变阴性之间也发现了差异性的共现变异(图2)。

     • .EGFR突变患者cfDNA与临床结果:对不同时期的TKI治疗患者的cfDNA进行分析发现了治疗能够诱导基因组共现变异的进化(图3)。

     •  基因组纵向时空的表征分析:伴随TKI治疗和抗性的进展,在诊断期患者超过75%的编码区突变呈克隆级别,但在死亡时下降到50%-58%,同时出现了亚克隆的突变(图4)。

研究结论:

      本研究强调了开展更多知情的及基因上授权的,包括分子诊断、监测及动态应用多种理性的治疗策略的重要性,来处理克隆和亚克隆的共现变异,从而更好地控制癌症。而且本研究所揭示的内容有助于改变当前关于对癌基因呈阳性肺癌的认识,也为基础和临床研究提供了未来的方向。


图1 晚期EGFR突变阳性与阴性肺癌患者间cfDNA共现的基因组变异


图2 440例EGFR p.Thr790Met突变阳性和682例突变阴性晚期NSCLC患者共现的基因组变异比较


图3 EGFR突变晚期NSCLC患者cfDNA中检测到随治疗诱导的基因组共现变异的进化


图4 一例EGFR突变患者从诊断到死亡期间肿瘤及cfDNA纵向基因组分析

参考文献:

      [1] Blakely CM, Watkins TBK, Wu W, Gini B, Chabon JJ, et al. (2017) Evolution and clinical impact of co-occurring genetic alterations in advanced-stage EGFR-mutant lung cancers. Nat Genet 49: 1693-1704. DOI: 10.1038/ng.3990.

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