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技术服务

动植物多倍体SSR分型技术SSRseq

动植物多倍体SSR分型技术SSRseq

技术简介:

       SSRseq技术针对目的区域SSR设计多重PCR扩增体系,一个扩增反应体系可以完成16-20个SSR标记的PCR反应,然后对目的片段实进行二代测序。此技术可以直接检测到同一SSR位点不同等位基因的序列信息,不但能达到单碱基分辨率,并且能够准确给出每个等位基因SSR重复单元的具体重复次数和不同等位基因的相对比例,不需要人工判读基因型,基于生物信息学分析流程高效、准确分型,适用于二倍体物种,尤其适合异源多倍体物种SSR位点检测。



应用领域:

     • 遗传多样性
     • 物种亲缘关系分析
     • 品种鉴定(例如无性繁殖的果树; 自交系玉米、中药材)
     • QTL定位
     • 连锁分析

技术优势:


     • 采用二代测序平台,精确检测重复单元数目和不同等位基因的相对比例;
     • 独创的“滑移校正”及“扩增效率校正”,避免将滑移峰误判为等位基因;
     • 目标序列已知情况下,避免插入缺失引起的基因型误判;
     • 避免将非特异性扩增条带误判为等位基因;
     • 不同SSR标记扩增产物长度不需要分子量大小梯度变化;
     • 不需要人工判读基因型,基于生物信息学分析流程高效、准确分型;
     • 相对于传统技术,高通量、低费用。

适用范围:


     • 适用于100个到上千个样品,10到上百个SSR位点检测。
     • 适用于二倍体物种,尤其适合异源多倍体物种SSR位点检测,如乔木(茶树、油桐、核桃树、榛子、杜仲、枣树、桃树)、小乔木(荔枝、枇杷、樱桃)、灌木(杨梅、杞柳、越桔)、蔬菜(茄子、甘蓝型油菜)、藤本植物(葡萄)、草本植物(百合、大豆、甘蔗、魔芋)、花卉(地涌金莲、玫瑰)、玉米、棉花、小麦、牦牛、驴等。

技术参数与实验流程


技术参数


样本要求 位点要求 测序策略 数据要求
  • 样品类型: DNA
  • 样品总量:总量需求(单个Panel需要40 ng)
  • 样本浓度:不能低于20 ng/µl
  • 样品质量:260/280介于1.7-2.0之间
  •  重复单元不少于3 bp
  •  重复数10个以内
  •  重复单元不全由GC或AT组成
  •  SSR位点周围不存在其他SSR位点
  •  测序深度:1000X~5000X(根据物种染色体倍数,如二倍体1000 X;四倍体的2500 X;六倍体5000 X)
  •  测序平台:Nextseq500 2 X 150 bp
  •  总分型成功率大于90%

A.建库测序流程



B.数据分析流程



经典文章解读


案例:中国特有针叶树华山松的微卫星标记特征解析

背景:

      华山松是一种常绿针叶树种,是中国中部和西南部特有的树种,以往对华山松的研究主要集中在其生理生态学,近年来,由于乱砍滥伐和自然栖息地破坏,华山松自然种群已显著降低,因此了解其种群遗传结构与遗传多样性对制定有效的保护和管理措施是十分必要的。在这项研究中,对华山松及其近源物种的SSR多态性进行了阐述从而有助于它们下一步的群体遗传学研究。

结果:

       从新鲜针叶中提取基因组DNA,使用Illumina MiSeq PE300,得到6,783,777个clean reads,使用CLC Genomics Workbench version 7.5组装得到350,628个contigs,使用SciRoKo version 3.1提取了含有SSR的contigs,从这些contigs中找到887个SSR候选位点,然后针对这些候选SSR位点设计引物,设计引物的标准是:(1)大小在100-350bp;(2)引物大小18-25 bp,最佳大小为20 bp;(3)引物熔解温度从55°C-63°C,最佳熔解温度为60°C;(4)GC含量为40%-60%。



       随机挑选50对SSR引物在3个华山松自然群体的52个个体中测试其扩增效率和多态性。使用GenAlEx version 6.501来评价微卫星位点的各种群体遗传参数,包括每个位点的等位基因数,预期和观测到的杂合度(He和Ho)和Hardy-Weinberg(HWE),使用GENE-POP version 4.2.2来计算LD值, 并且使用MICRO-CHECKER version 2.2.3计算了无效等位基因频率。

       50对SSR引物中共有34对引物成功扩增出PCR产物,其中18个位点表现出多态性(表1)。这些多态性引物的等位基因数范围是2-5,平均2.4。

       预期杂合度(He)范围是0.061~0.609,平均0.384;观测到的杂合度(Ho)范围是0.063-0.947,平均0.436(表2)。两对引物(pa3553和pa118137)HWE被发现大大偏离。这种偏差可能是样本量不足,个体之间的非随机交配,迁移,或自然选择这两个位点造成的。


表2:3个华山松自然群体的遗传多样性


      为了使开发的这些SSR位点得到更广泛的应用,本文检测了这18对引物在其它5种与华山松较同源的松树中(红松、乔松、西伯利亚红松、偃松、白皮松)的效果。结果发现这18对引物中有17对引物能在这5种松树中扩增出明显条带,而引物pa3553在偃松和白皮松中则不能扩增出条带(表3)。


表3:在华山松中呈现多态性的18个SSR引物在其它5种松树中的分型结果


参考文献:

      Characterization of Polymorphic Microsatellite Markers in Pinus armandii(Pinaceae), an Endemic Conifer Species to China

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