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10xGenomics单细胞转录组测序

10xGenomics单细胞转录组测序

服务介绍:

单细胞转录组研究极大地提高了我们对于组织、器官和生物体复杂性的认知,单个细胞中的基因表达特征显示了细胞类型和亚群的空前的多样性,而传统的转录组技术方法无法揭示这些重要信息。

10x Genomics单细胞转录组测序是基于油包水液滴进行单细胞分离,并针对单个细胞内的mRNA 进行扩增和高通量测序的一项新技术。单细胞表达谱的绘制能够完美地揭示细胞间基因表达的异质性,并解释异质性对所研究的生物学问题的贡献度;能够从复杂生物样本中发现表征稀有细胞类型;能够在无参考靶标的情况下发现新的靶点、标志物、细胞类型和状态;能够在成千上万个细胞中同时进行高通量和高分辨率的功能基因的筛选。10x Genomics单细胞转录组测序适用于绝大部分细胞类型,并且已被广泛应用于肿瘤、遗传健康、免疫、生殖发育、神经、非肿瘤复杂疾病、植物、微生物等众多方向

技术参数及分析内容


技术优势


   • 高通量单细胞分析方法中具有最高的灵敏度、准确性和一致性
   • 能够实现快速分选,一次可对1000-10000个细胞进行建库
   • 具有极高的灵敏度,细胞捕获效率高达65%
   • 实验流程简单,细胞大小选择更灵活
   • 双细胞比例仅为0.9%/1000个细胞
   • 同时适用于单核转录组测序

技术路线


经典案例解读

文章标题:Single-Cell Deconvolution of Fibroblast Heterogeneity in Mouse Pulmonary Fibrosis

发表杂志:Cell Reports

影响因子:7.815

发表时间:2018年3月

    2018年3月洛杉矶西奈医学中心的团队于Cell Reports杂志发表了题为“Single-Cell Deconvolution of Fibroblast Heterogeneity in Mouse Pulmonary Fibrosis”的文章,利用10x Genomics单细胞转录组测序技术(scRNA-seq)揭示了小鼠肺纤维化过程中成纤维细胞的异质性。利用博来霉素(Bleomycin)诱导小鼠肺纤维化,然后经组织解离和分选,利用10x Genomics scRNA-seq比较正常肺和纤维化肺中的间充质细胞的差异(Figure1)。

Figure1 实验设计流程图

主要研究结果:

    正常肺(D0)和纤维化肺(D21)中分析的间充质细胞数量分别为1,943和3,386个,基于已知的marker基因的表达可将细胞类型分为6种和7种,以t-SNE图和Heatmap展示如Figure2。

Figure2 单细胞测序揭示MCs聚类信息

    文章以相同的分析模式分别剖析了各细胞亚型,包括肌成纤维细胞(Myofibroblasts, Figure3)、Col13a1高表达的基质成纤维细胞(Matrix fibroblasts)、Col14a1高表达的基质成纤维细胞、脂成纤维细胞(Lipofibroblasts)、间充质祖细胞(Mesenchymal Progenitors)、间皮细胞、Pdgfrb高表达的成纤维细胞(Figure4)及内皮细胞。分析的内容主要包括相应细胞类型的marker基因表达、正常肺和纤维化肺中代表性marker基因展示、代表性的lncRNA表达结果、差异表达基因的热图展示及转录因子相关基因表达情况。Figure3和Figure4分别仅以肌成纤维细胞和Pdgfrb高表达的成纤维细胞展示结果。

Figure3 肌成纤维细胞基因表达特征

    (A and B)肌成纤维细胞t-SNE可视化结果;(C)已知的marker基因表达差异;(D and E)D0和D21样本中肌成纤维细胞差异表达基因小提琴图;(F)部分lncRNA表达信息;(G)显著差异表达基因热图展示,包括细胞外的和质膜编码基因;(H and I)肌成纤维细胞转录因子表达特征

Figure4 Pdgfrb高表达的成纤维细胞基因表达特征

    最后基于自组织映射(SOMs)机器学习(machine learning)方法利用单细胞R分析工具(SCRAT)确定肺纤维化过程中每个MCs亚群的基因集特征,在正常(Figure5A)和肺纤维化(Figure5B)的条件下MC亚型显示了特定的基因特征,包括细胞外区域(extracellular region)、细胞外空间(extracellular space)、核糖体、质膜等。对MCs利用SCRAT进行拟时轨迹分析发现D0和D21状态下呈现不同的谱系层次(Figure5C and D)。

Figure5 MCs亚群基因集分析和拟时分析

    文章中结合已有的有关间充质细胞的单细胞测序结果与本次实验结果进行了比较分析,同时进行了深入的讨论。总体上来看文章的实验设计思路清晰明了,诱导前后的两个样本单细胞分析数据进行对比,分析内容较为简单,但是详细比较和讨论了该领域的研究结果,在细胞分选和小鼠模型的构建上比较严格,为其它研究方向特别是利用模式动物筛选药物观察哪类细胞在处理过程中发生重要变化提供了良好的借鉴!

测序数据及细胞质控统计结果

质控前(上图)和质控后(下图)细胞表达量统计结果

tSNE聚类图

聚类间差异倍数最高top10的标记基因表达量热图

标记基因在聚类中高表达分布图

标记基因在聚类中表达量小提琴分布图

拟时轨迹分析图

不同分辨率下的tSNE聚类图展示

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