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天昊客户新文: 体外模拟消化和发酵中枸杞蜂花粉多糖对肠道菌群的影响

 
       南京农业大学食品科学与技术学院近期在《Journal of Agricultural and Food Chemistry》上发表了枸杞蜂花粉多糖体外模拟消化和发酵以及其对肠道菌群影响的文章,在这项研究中天昊生物有幸承担了样品的扩增子测序和生物信息学分析工作。在恭喜天昊生物客户发表微生物文章同时,我们想跟大家分享一下文章的研究思路。
英文题目:Simulated Digestion and Fermentation in vitro by Human Gut Microbiota of Polysaccharides from Bee Collected Pollen of Chinese Wolfberry
期刊名:Journal of Agricultural and Food Chemistry  发表时间:2018年1月
影响因子:3.1540
研究背景:
        蜜蜂采集的花粉,由花粉粒,少量蜜蜂分泌的唾液和植物蜜源组成,含有丰富的营养物质,如蛋白质、碳水化合物、氨基酸、核酸、酚类、脂肪酸、矿物质和维生素。因此,蜂花粉被用作人的膳食补充剂。近年来,蜂花粉多糖及其生物活性的研究已有报道:蜂花粉多糖具有免疫调节、抗氧化和抗肿瘤活性等功效。近年来,越来越多的研究证明,植物多糖可被肠道菌群降解,然后通过代谢产物影响宿主的健康,例如短链脂肪酸可以降低结肠pH值和预防各种疾病,同时多糖能改变肠道群落的组成:茯砖茶中的多糖能显著刺激拟杆菌属和普雷沃菌属,它们是降解膳食纤维的肠道菌群关键成员;灵芝菌丝体多糖能降低高脂饮食引起的肠菌群失调;杏鲍菇多糖可通过提高拟杆菌科和乳杆菌从而促进免疫因子的分泌量从而有助于宿主的免疫反应。然而目前关于枸杞蜂花粉多糖(WBPPS)对肠道健康影响的研究鲜有报道。
研究目的:
        本文目的是探讨枸杞蜂花粉多糖的体外消化和体外发酵,此外调查枸杞蜂花粉多糖(WBPPS)发酵对短链脂肪酸(SCFA)产生和肠道菌群结构的影响。
研究思路:
        WBPPS制备和WBPPS特征分析
        模拟唾液、胃液、小肠液消化WBPPS
        体外发酵后还原糖含量、pH 和短链脂肪酸(SCFAs)测定
        体外发酵后肠道菌群分析
体外厌氧发酵
        1克WBPPS(WBPPS组)或菊粉(INL组)(阳性对照)溶解在100毫升蒸压基本营养生长培养基中,最终浓度为10毫克/毫升(W / V);无任何碳源的基础营养生长培养基作为空白对照(BLK组)。招募3名在3个月内不服用任何抗生素的健康志愿者,用无菌磷酸盐缓冲盐水(0.1 M, pH 7.2)悬浮粪便制备粪浆(10%, w/v)。微生物发酵系统由1毫升粪浆和9毫升含有WBPPS或菊粉的培养基组成。发酵系统在37℃MGC缺氧密闭系统进行,取0, 6, 12, 24 h发酵样品进行进一步研究,每个包含3个生物学重复。
肠道菌群分析
        本研究包括4组体外发酵:原始粪浆组(OR组);没添加任何碳源体外发酵24 h(BLK组);添加WBPPS体外发酵24 h(WBPPS组);添加菊粉体外发酵24 h(INL组)。
Miseq测序
细菌测序区段为:(V4),12个样本共得到565851条可用序列。
研究结果:
        枸杞蜂花粉多糖(WBPPS)通过热水提取、乙醇沉淀和冷冻干燥获得,枸杞蜂花粉多糖(WBPPS)主要包含甘露糖、核糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖,摩尔比分别为0.38: 0.09: 0.17: 0.64: 0.22: 0.67: 0.08: 1.03,说明它是杂多糖。
        此外,在WBPPS的高效凝胶色谱观察到两个峰,A部分(主要部分,87.02%)和B部分(13.98%),分子量分别为1340.1和523.2 kDa(图1a)。


 
图1 WBPPS(a)、唾液消化后(b)、模拟胃液消化后(c)和模拟小肠液消化后(d)的高效凝胶渗透色谱。
 
唾液消化WBPPS
        唾液是第一个消化液样品,其主要包括唾液淀粉酶,如图1b所示,唾液处理WBPPS后组分A和B的保留时间和峰面积没有变化,表明人的唾液不能消化WBPPS。此外唾液处理前后还原糖含量没有明显差异(表1),说明WBPPS不能被唾液降解。

表1  唾液、模拟胃液和模拟小肠液消化WBPPS不同时间点的还原糖含量。
 

 
模拟胃和模拟小肠消化WBPPS
       如图1c所示,在模拟胃条件下消化6小时内 WBPPS的A组分保留时间和峰面积没有改变,表明A组分保不受模拟胃液的影响。然而B组分逐渐降解,观察到一个新峰(组分C),组分C是WBPPSB组分的部分降解产物,其分子量为2.68±0.36 kDa。此外,模拟胃液消化中还原糖的含量显著增加(表1)。然而整个胃消化全过程WBPPS没有自由单糖的产生(图2a),表明B组分降解不产生游离单糖,而是诱导还原糖增加。
       如图1d所示,模拟小肠消化后WBPPS的A组分保留时间和峰面积没有改变,表明A组分也不受模拟小肠液的影响。但由于模拟小肠的消化,C组分转化为D组分(分子量1.27 ± 0.03 kDa)。模拟小肠消化过程WBPPS也没有自由单糖的产生(图2b, 表1)。
       以上所有结果说明模拟胃液和模拟小肠液对WBPPS的降解影响较小,WBPPS可以以一个相对不变的状态运送到结肠,因此预计肠道菌群可以利用WBPPS,因此本研究想通过新鲜人粪对WBPPS进行体外发酵,从而评估由于WBPPS体外发酵对短链脂肪酸和肠道菌群产生的影响。

 

 
图2  模拟胃液消化后(a)和模拟小肠液消化后(b)WBPPS释放的游离单糖高效液相色谱。1、甘露糖;2、核糖;3,鼠李糖;4、葡糖醛酸;5、半乳糖醛酸;6、葡萄糖;7、半乳糖;8、木糖;9、阿拉伯糖;10、岩藻糖。
 
WBPPS体外发酵对短链脂肪酸产生的影响
       如图3a所示,WBPPS在体外发酵过程中逐渐降解,表明WBPPS能被肠道菌群利用。
       如图3b所示,发酵24 h后BLK、WBPPS 和INL组的pH值分别从8.93、7.95和8.90下降到7.59、5.49和4.15,这表明,与BLK组相比WBPPS添加对肠道环境的pH值有较大影响。此外,在相同的发酵时间点,WBPPS组的pH值低于BLK组,但是高于INL组,因此推测pH值与体外发酵过程产生的短链脂肪酸水平相关。


 
图3  WBPPS体外发酵不同时间点的高效凝胶渗透色谱(a);pH值(b);
 
        通过发酵,WBPPS组总SCFAs浓度从6.40±0.32增加到44.97±1.30 mM(表2),显著高于BLK组,这表明WBPPS能提高短链脂肪酸的产生。
        随着BLK组相比,WBPPS组显著提高了乙酸和丙酸的产生。通过发酵,WBPPS组乳酸的浓度从0.13 ± 0.03 (0 h) 增加到1.69 ± 0.08 mM (6 h),然后下降到0.48 ± 0.05 mM (24 h),这可能是人类肠道菌群产生的乳酸转变为其它的短链脂肪酸。发酵24小时,BLK组的异戊酸和正戊酸浓度分别比WBPPS组高3.5倍和1.5倍。对于INL组,在每个时间它具有浓度最高的乳酸、乙酸和最低的异丁酸,正丁酸,异戊酸和正戊酸。总之WBPPS和INL(菊粉)一样能促进短链脂肪酸的产生。

表2 体外发酵不同时间点发酵液中的短链脂肪酸浓度。
 

 
WBPPS体外发酵对肠道菌群的影响
        BLK, WBPPS 和INL各组间在微生物丰度上没有明显差异,然而,在微生物多样性方面WBPPS 和INL组均低于BLK组(表3)。
        如图3c和图3d所示,各组的菌群结构表现出明显的分离。

表3 不同处理组样品的α多样性。
 

 

 
图3  各组菌群结构的PCA分析(c);各组菌群结构的聚类分析(d)。
 
        如图4a所示,所有组主要由厚壁菌门(Firmicutes),拟杆菌门(Bacteroidetes)和变形菌门(Proteobacteria)。值得注意的是,厚壁菌门和拟杆菌门的相对丰度在体外发酵24 h后在发生了很大的变化。梭杆菌门(Fusobacteria)和放线菌门(Actinobacteria)分别在BLK和INL组相对较多。这说明梭杆菌在无碳源(在BLK组)条件下会过度增长,而INL(菊粉)则会促进放线菌生长。
        据报道厚壁菌门/拟杆菌门(F/B)比值与肥胖密切相关,这是因为这两种菌对食物中能量的提取效率不同,一般肥胖患者中的F/B比值也较高。如图4b显示,与BLK组相比,WBPPS 和INL组的F/B比值显著降低,这说明WBPPS 和INL可以通过降低F/B比值来影响宿主健康。
        从图4c可以看出,人体肠道粪便中发现了45种主要菌属。与BLK组相比,5个菌属(Prevotella, Dialister, Megamonas, Faecalibacterium, Alloprevotella)在WBPPS组富集,据报道,高纤维饮食与Prevotella增加密切相关,这是因为Prevotella包含一组多糖降解酶基因,例如有报道Prevotella和 Xylanibacter这两种含有纤维素和木聚糖水解基因的菌仅存在于非洲农村儿童肠道中,而他们的饮食则富含淀粉、纤维和植物多糖。


 
图4 门水平肠道微生物组成(a)、厚壁菌门/拟杆菌门(F/B)比值(b)和属水平肠道微生物组成热图(c)。
 
总结:
       本文对枸杞蜂花粉多糖(WBPPS)的体外消化和发酵进行研究,枸杞蜂花粉多糖(WBPPS)主要包含甘露糖、核糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖。
       WBPPS不受人类唾液的影响。WBPPS的A部分(分子量为1340 kDa)在模拟胃液和小肠汁中未分解,而WBPPS的B部分(分子量为523 kDa)则被降解。
       体外发酵结果显示WBPPS能显著提高短链脂肪酸的生成。
       WBPPS通过增加Prevotella(普氏菌属),  Dialister(嗜血杆菌属), Megamonas(巨单胞菌属), Faecalibacterium(柔嫩梭菌属), Alloprevotella(拟普雷沃菌属)和减少Bacteroides(拟杆菌属),  Clostridium  XlVa(梭状芽胞杆菌XlVa),  Parabacteroides,  Escherichia/Shigella(埃希氏菌属/志贺氏菌属),           Phascolarctobacterium(考拉杆菌属), Parasutterella, Clostridium sensu strict(梭菌属)、Fusobacterium(梭形杆菌属)来调节肠道菌群的组成。
 




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