咨询热线:400-065-6886   天昊基因

中文 / English

主页 > 市场动态 > 公司新闻 >
天昊客户新文: 苦丁茶中二咖啡酰奎宁酸对肠道微生态调节作用

 
        南京农业大学食品科学与技术学院近期在《Journal of Agricultural and Food Chemistry》上发表了苦丁茶中二咖啡酰奎宁酸对肠道微生态调节作用的文章。在恭喜天昊生物客户发表微生物文章同时,我们想跟大家分享一下文章的研究思路。
英文题目:Modulating Effects of Dicaffeoylquinic Acids from Ilex Kudingcha on Intestinal Microecology in vitro 
中文题目:苦丁茶中二咖啡酰奎宁酸对肠道微生态的调节作用
期刊名:Journal of Agricultural and Food Chemistry     
发表时间: 2017年10月    影响因子: 3.1540
材料方法:
实验设计

        体外发酵实验共包含11组:一组不加碳水化合物(BLK)和四组包含不同碳水化合物(Glu,SUC,GOS和INL);一个原始状态组(OR)和五组添加苦丁茶二咖啡酰奎宁酸(diCQAs)。
材料与试剂
       苦丁茶、葡萄糖(Glu)、蔗糖(SUC)、菊粉(INL)、糖麻(GOS)、乙酸、丙酸、n-butyric、i-butyric、n-valeric、i-valeric、2-ethylbutyric acids、甲醇、甲酸。
diCQAs制备
       苦丁茶diCQAs根据报道方法进行一些修改:苦丁茶用热水提取,产生的输液过滤,冷却至室温,装上大孔树脂柱吸附,用紫外分光光度计在线监测柱,用纯水洗脱,直到出水在325 nm处不吸收,用乙醇溶液(70%,v/v)洗脱目标部位,收集出水真空浓缩、冷冻冻干。
体外厌氧发酵
       使用粪便微生物体外厌氧发酵的方法来调查diCQAs对肠道菌群的影响。粪便样品从4名健康志愿者获得(2名男性和2名女性,22 - 28岁),没有任何胃肠道疾病或在过去的3个月没服用任何抗生素、益生菌、益生元、泻药。将粪便样品混合在一起,用蒸压生理盐水溶液稀释10次,得到10%(w/v)悬浮液。悬浮液离心4℃,而上清液用于下面发酵的粪浆。准备基础营养生长培养基,葡萄糖(Glu)、蔗糖(SUC)、菊粉(INL)、糖麻(GOS)(10 g/L)分别添加到培养基中。微生物发酵系统由2毫升粪浆和18毫升培养基组成。不添加diCQAs含葡萄糖、蔗糖,糖麻、菊粉、不加任何碳水化合物分别定义为GLU, SUC, GOS, INL,BLK;而添加diCQAs (1.0 g/L) 含葡萄糖、蔗糖,糖麻、菊粉、不加任何碳水化合物分别定义为GLUD, SUCD, GOSD, INLD, BLKD。每个体外发酵试验包含3个生物学重复。发酵系统在MGC缺氧密闭系统进行,37℃孵育24 h。每6小时轻轻摇动,使发酵系统尽可能均匀。培养后,采样用于细菌DNA提取,冻在20℃用于SCFA分析。
Miseq测序
细菌测序区段为:(V4)

 
研究结果:
厌氧发酵后菌群的丰富度和多样性。

        33个样本的平均测序数据量(clean data)为43029 ± 6733 序列。共检测到316 个OTUs,平均每个样本检测到160 ± 21 OTUs。稀释性曲线和Shannon曲线表明大多数物种被检测到(图1)。


 
图1 所有样本的稀释性曲线(a)和香农指数曲线(b)。
 
        α多样性指数如表1所示:INL组微生物多样性最低,而BLK组微生物多样性最高。与不添加diCQAs组相比,添加苦丁茶diCQAs增加了α多样性。无碳水化合物培养时,diCQAs添加会降低微生物多样性(与BLK相比,BLKD的Shannon指数更低,而Simpson指数更高)。据报道,肠道菌群多样性与宿主健康密切相关,肥胖个体肠道微生物多样性显著低于瘦肉型个体,Shannon指数与脂肪组织呈显著负相关。本研究结果表明:diCQAs能增加肠道菌群多样性,表明苦丁茶的diCQAs具有通过调节肠道菌群抵抗肥胖的能力。

表1 各组α多样性指数分析
 

 
diCQAs对整体微生物结构影响
        聚类分析结果表明,所有样品可分为两个主要群体:diCQAs添加组和无diCQAs组,无碳水化合物添加发酵组(BLK和BLKD)与diCQAs添加组比较相近,OR组与无diCQAs组比较类似(图2a)。
        不同类型碳水化合物添加发酵组可以分为不同的亚群,但是它们之间的距离小于diCQAs引起的距离(图2b)。
        NMDS分析表明diCQAs添加组(GLUD, SUCD, GOSD, INLD, 绿色圈)和无diCQAs组(GLU, SUC, GOS, INL, 蓝色圈)在Axis 1完全分离,说明它们之间有明显差异(图2c)。
        CCA分析表明DiCQAs对体外发酵的影响要明显大于碳水化合物(葡萄糖、蔗糖、糖麻和菊粉)影响,这表明DiCQAs是肠道菌群的主要调节因素。


 
图2  OTUs水平微生物的聚类分析(a)、热图分析(b)、NMDS分析(c)、CCA分析(d)。
 
门和属水平微生物群落组成
        所有的发酵样品主要包括厚壁菌,拟杆菌,变形菌、放线菌、梭杆菌(图3a)。
        添加diCQAs降低了各类型碳水化合物条件下厚壁菌门的相对丰度(图3b)。
        DiCQAs对拟杆菌的相对丰度影响不大,除了GOS作为碳源时DiCQAs显著降低其丰度(图3c)。
        在所有碳水化合物甚至不加碳水化合物条件下,添加DiCQAs降低了厚壁菌门/拟杆菌门(F / B)比例(图3d)。肠道菌群的吸收能力与F / B值密切相关,添加DiCQAs导致F / B值降低预示着其抗肥胖的潜在能力。
        添加DiCQAs显著增加放线菌丰度,特别是在GOS发酵组(图3e)。类似于DiCQAs,槲皮素和儿茶素已被报道可以提高放线菌丰度,但葛根素则没有这种能力。

 

 
图3门水平微生物组成(A、群落结构柱状图;B、厚壁菌门的相对丰度;C、拟杆菌门的相对丰度;D、厚壁菌门/拟杆菌门(F / B)比例;E、放线菌门的相对丰度)。

        属水平微生物组成图显示(图4),DiCQAs可以增加碳水化合物发酵组中Bacteroides(拟杆菌),  Bifidobacterium(双歧杆菌)和 Escherichia/Shigella(大肠杆菌/志贺菌)的丰度,同时降低Prevotella(普氏菌),  Megamonas(巨单胞菌), Dialister(嗜血杆菌),Anaerostipes丰度。值得注意的是,GOSD组双歧杆菌的丰度高于GOS组和其它DiCQAs添加组,表明α- GOS和DiCQAs可协同促进双歧杆菌增殖。

 
图4 属水平上的微生物组成(A、群落结构柱状图;B、热图)。
 
DiCQAs对微生物组成差异的影响
        LEfSe分析显示在葡萄糖、蔗糖、糖麻和菊粉存在情况下,添加diCQAs可以分别增加20, 17, 20和22个属丰度(其中有14个属是组间共有),也可以分别减少10,10,11,8个属丰度(其中有6个属是组间共有)(图5)。


 
图5  属水平上的LEfSe分析(A, GLU vs. GLUD; B, SUC vs. SUCD; C, GOS vs. GOSD; D, INL vs. INLD)。
 
        把无diCQAs组(GLU, SUC, GOS, INL)定义为C群,diCQAs添加组(GLUD, SUCD, GOSD, INLD)定义为CD群。C群和CD群的差异趋势与上面不同碳水化合物条件得到的比较结果一致。在门水平,CD组比C组具有较高丰度的放线菌门和变形菌门,而厚壁菌门在C组更常见。在纲水平,添加diCQAs减少了Negativicutes丰度, 增加了放线菌纲,芽孢杆菌纲,γ-变形菌纲,α-变形菌纲丰度。在科水平,添加diCQAs增加了双歧杆菌科等12个物种丰度,同时抑制了Sreptococcaceae, Prevotellaceae,Veillonellaceae等物种丰度。很显然,diCQAs表现出对双歧杆菌增殖显著的正效应。而双歧杆菌是一种被广泛研究的益生菌,它能降低肥胖的风险和发生率,其丰度与肥胖者内毒素水平呈负相关。其促进健康的机制涉及多种作用,如粘附到肠上皮细胞,产生有益的代谢产物,增强肠道屏障,调节免疫反应,以及竞争性排斥病原体。


 
图6 无diCQAs组(C)和diCQAs添加组(CD)属水平上的LEfSe分析。
 
diCQAs对短链脂肪酸(SCFA)的影响
        大肠是人类产生短链脂肪酸的主要场所,栖息在那里的肠道微生物起着至关重要的作用。有机酸,包括乳酸、丙酮酸和乙酸,都来自碳水化合物的发酵,也可以由微生物进一步转化为丙酸和丁酸。短链脂肪酸对维持人体健康具有多功能,并能保护肠黏膜屏障,降低炎症反应水平,刺激肠胃蠕动。丁酸是一种重要的微生物代谢产物,它是结肠上皮细胞的主要能量来源,具有调节宿主基因表达,细胞分化和凋亡的功能。乙酸能促进肠粘液分泌,丙酸可能在调节食欲方面起关键作用。
        本文短链脂肪酸(SCFA)分析结果如表2所示,在所有的短链脂肪酸中,乙酸,丙酸和乳酸是最丰富的有机酸,丁酸也占一定比例。在无任何碳水化合物条件下,diCQAs抑制所有有机酸(除乳酸)和总酸,例如在它们的浓度在BLKD组中较BLK组低。在任何碳水化合物条件下,添加diCQAs可促进乙酸和乳酸产生,例如 (GLUD, SUCD, GOSD)组较(GLU, SUC, GOS)组多;添加diCQAs可减少丙酸和n-butyric(正丁酸)的含量。此外,BLK组的i-butyric, n-butyric,i-valeric 浓度最高。

表2 短链脂肪酸、乳酸和总酸的浓度
 

 
总结:
        膳食多酚已被视为新的益生元,多酚可以通过调节肠道菌群发挥作用。苦丁茶的多种生物活性可能来源于它的酚类化合物,但苦丁茶中二咖啡酰奎尼酸(diCQAs)对肠道菌群的影响目前没有被调查过。研究发现diCQAs可以提高微生物多样性,并且diCQAs对微生物的影响高于碳水化合物(葡萄糖、蔗糖、糖麻和菊粉)对微生物的影响。添加DiCQAs可以增加拟杆菌、双歧杆菌、梭状芽孢杆菌、志贺氏菌等菌相对丰度,降低瘤胃球菌,小杆菌,巨型球菌等菌相对丰度。DiCQAs也可以通过微生物影响了短链脂肪酸的产生,例如乙酸和乳酸含量增加,丙酸和丁酸生成减少。总的来说,苦丁茶中的二咖啡酰奎尼酸(diCQAs)在体外对肠道菌群有显著的调节作用,这表明diCQAs具有被开发成功能性食品的潜力,通过促进肠道健康预防疾病的发生。


 
关于天昊:
      天昊生物采用Miseq PE250测序策略对细菌16S rDNA区/真菌ITS区/真菌18S rDNA区的双V区或多种单V区进行测序,使用低循环数扩增,保证每个样品扩增的循环数统一;采用特殊方法可有效避免系统内误差;数据质量高,有效序列Q30达到90%以上;加上最新升级的分析内容和解释详尽的结题报告,带您享受极致的微生物扩增子测序体验。




上海天昊生物科技有限公司 版权所有 沪ICP备17008908号
地址:上海市浦东新区康桥路787号9号楼 邮箱:techsupport@geneskies.com 电话:400-065-6886